第八章 基因工程;重组DNA技术;;;;;基因工程的应用; 首字母◈✿★ღ： 大写◈✿★ღ：细菌属名 2-3字母◈✿★ღ： 小写◈✿★ღ：细菌种名 如 EcoR 1 4 : 大写: 菌株 1◈✿★ღ，2…: 分离到的次序;;（2）产生平末端(blunt end):;5.同尾酶(isoaudamers): 识别序列不同,但产生相同的粘性末端 BamH 1 :G?GATCC Sau3A 1: N?GATCN ;1◈✿★ღ、DNA聚合酶 大肠杆菌中第一个发现◈✿★ღ，MW 109KD 方向◈✿★ღ：5＇?3＇ 还具有5‘?3’及3‘?5’外切酶活性. 缺口平移法标记DNA时常用; 两类◈✿★ღ：禽类成骨细???性白血病病毒逆转录酶（AMV） moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV） 方向◈✿★ღ：5‘?3’ 作用◈✿★ღ：以RNA为模板合成DNA◈✿★ღ，构建cDNA文库 ;4尊龙人生就是傅◈✿★ღ，◈✿★ღ、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）;内切酶◈✿★ღ、碱性磷酸酶◈✿★ღ、连接酶的作用; *分类◈✿★ღ： 克隆载体 质粒 入噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体 表达载体 大肠杆菌表达载体 哺乳动物表达载体 ;质粒载体 大肠杆菌质粒载体 PBR322 枯草杆菌质粒载体 PNC3 酵母菌质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 Ti 噬菌体载体 ? 噬菌体载体 Cos噬菌体载体 病毒载体 SV40病毒载体 乳头瘤病毒载体 ;⑴ 分子量相对较小◈✿★ღ，在细菌中稳定存在◈✿★ღ， 拷贝指数高◈✿★ღ。 ⑵ 具有遗传标记◈✿★ღ： 如抗生素性基因 ?—半乳糖酶基因（LacZ） ⑶ 具有多个酶的单一切点◈✿★ღ。称多克隆位点（ multiple cloning sites , MCS） 如 PBR322(人工合成)4.3Kb ◈✿★ღ：含 AmP?(氨卞青霉素)◈✿★ღ、 Tet?(四环素) 24个单一切点;PBR322;质粒的构建;质粒携带外源基因; 溶菌性（Lytic）◈✿★ღ：在细菌中连续增殖直到细菌裂时Z6尊龙凯时官网◈✿★ღ！◈✿★ღ， 释放噬菌体◈✿★ღ。 溶原性（Lysogenic）◈✿★ღ：将其DNA整入细菌中◈✿★ღ。 **只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期◈✿★ღ。;噬菌体的溶原周期和溶菌周期;; 插入型载体◈✿★ღ：外源DNA克隆到?分子上◈✿★ღ，使噬菌体的某种生物 功能丧失效力◈✿★ღ，即插入失活效应基因工程◈✿★ღ。 如◈✿★ღ：?—半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选） 编码 ;;②取代型载体（又叫替换型载体） 图8-4基因工程原理P258;*由?DNA的Cos区与质粒构建 *环状双链DNA 特点◈✿★ღ；①含质粒的抗性标记如Amp?◈✿★ღ，Tet? ②带Cos区◈✿★ღ，可进行体外包装 ③一个或多个酶切位点 ④分子量小◈✿★ღ，容量大 /筛选AP平板;;;（1）大肠杆菌噬菌体 （2）基因组DNA全长6.5kb（单链） （3）感染后◈✿★ღ，可复制成双链DNA（RF尊龙人生◈✿★ღ，DNA） （4）当RF→100—200后◈✿★ღ，只有（+）链复制 4种常用载体的比较 P146 表8—2 筛选◈✿★ღ：蓝白筛选;;在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体◈✿★ღ。;除含有原核序列◈✿★ღ：在E-Coli中的复制起始点◈✿★ღ、便于筛选的抗性基因 还包括真核表达元件 启动子/增强子 克隆位点 终止信号和加poly（A）信号;1. 特点◈✿★ღ：①遗传背景清楚——利于研究 ②繁殖快——易获得大量基因产物（20’一代） ③含质粒——利于基因转移 ④表达非E-Coli基因◈✿★ღ，其潜力几乎是无限的; 特点◈✿★ღ：①安全性大 ②遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达 ③基因产物外分泌 遗传背景较清楚 具基因表达后加工机制 ;⑴目的基因的获得 ⑵载体的选择与制备 ⑶目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） ⑷重组DNA导入受体 ⑸重组体筛选和鉴定 ⑹目的基因表达 ⑺基因产物的分离纯化 ;—. 目的基因的制备 方法◈✿★ღ： 1. 内切酶法 2. 机械力降解 3. 化学合成 4. cDNA合成 5. PCR制备法 6. 从基因文库中提取;2◈✿★ღ、机械降解法;4. PCR（polymerase chain reaction）;1. 粘性末端连接 5′—末端连接（易） 3′—末端连接（难） ;2◈✿★ღ、 利用人工接头（linker）连接;3◈✿★ღ、 加入同聚体尾连接◈✿★ღ：;;4. 平端连接 所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比老司机软件库 软件合集◈✿★ღ，粘性末端连接要高些（大于2.5倍）;转化程序◈✿★ღ： 感受态细胞+质粒DNA 42℃◈✿★ღ、90sec 不含抗生素的培养基热休克 37℃ 涂布选择性平板 37℃ 得到细胞的克隆 30-60min （合适抗生素） 10hr （使质粒扩增）;?DNA ?E-coli 转染 动◈✿★ღ、植物病毒DNA ?动植物细胞 （transfection） ?噬菌体颗粒? E-coli 感染 病毒颗粒 ?动老司机软件库 软件合集◈✿★ღ、植物细胞 ; （1）遗传学方法 （2） 免疫学方法 （3）核酸杂交法 （4）PCR技术 （5）酶切鉴定 ;;;A◈✿★ღ：当M13感染空载宿主后◈✿★ღ，产生完整的LacZ产物◈✿★ღ。 ?-半乳糖苷酶 Xgal X（兰色）+gal（无外源DNA） B◈✿★ღ：当M13插入了外源DNA后◈✿★ღ，其LacZ基因被破坏尊龙◈✿★ღ，不能与宿主细胞中LacZ的互补◈✿★ღ，产生LacZ产物◈✿★ღ。 Xgal X （兰色） （含外源DNA ?重组克隆） C◈✿★ღ：蓝白筛选◈✿★ღ：;2．免疫学方法 原理◈✿★ღ：以目的基因在受体细胞中的表达产物作为Ag◈✿★ღ，免疫动物制备Ab◈✿★ღ，通过Ag◈✿★ღ、Ab反应◈✿★ღ，将带目的基因的克隆筛选出来◈✿★ღ。 方法◈✿★ღ：放免◈✿★ღ、化学方法◈✿★ღ、显色反应等◈✿★ღ。;3. 核酸杂交法 从基因文库◈✿★ღ、cDNA文库或重组反应质粒中筛选目的基因◈✿★ღ。 将含有外源DNA的细菌生长在琼脂板上 ? 将NC膜或尼龙膜覆盖平板表面 ? NaOH处理膜 32P-DNA杂交或RNA ? X线曝光 ? 放射自显影 ? 阳性斑点 ;4. PCR技术 5◈✿★ღ、酶切鉴定 ;;;5◈✿★ღ、显微注射法（microinjection）; tk— tk— 转入外源tk ? tk+ A tk— A tk+ 细胞死亡 补救途径 ? 细胞存活;② 药物筛选细胞 如◈✿★ღ： neo?（新霉素抗性基因）对G418（新霉素衍生物）具有抗性◈✿★ღ。 ;;9◈✿★ღ、青少年是一个美好而又是一去不可再得的时期◈✿★ღ，是将来一切光明和幸福的开端◈✿★ღ。◈✿★ღ。6月-206月-20Thursday, June 4, 2020 10老司机软件库 软件合集◈✿★ღ、人的志向通常和他们的能力成正比例老司机软件库 软件合集尊龙◈✿★ღ。12:28:5512:28:5512:286/4/2020 12:28:55 PM 11◈✿★ღ、夫学须志也◈✿★ღ，才须学也◈✿★ღ，非学无以广才◈✿★ღ，非志无以成学◈✿★ღ。6月-2012:28:5512:28Jun-2004-Jun-20 12◈✿★ღ、越是无能的人◈✿★ღ，越喜欢挑剔别人的错儿◈✿★ღ。12:28:5512:28:5512:28Thursday, June 4, 2020 13◈✿★ღ、志不立◈✿★ღ，天下无可成之事◈✿★ღ。6月-206月-2012:28:5512:28:55June 4, 2020 14◈✿★ღ、古之立大事者◈✿★ღ，不惟有超世之才◈✿★ღ，亦必有坚忍不拔之志◈✿★ღ。04 六月 202012:28:55 下午12:28:556月-20 15◈✿★ღ、会当凌绝顶◈✿★ღ，一览众山小◈✿★ღ。六月 2012:28 下午6月-2012:28June 4, 2020 16尊龙凯时人生需要博◈✿★ღ，◈✿★ღ、如果一个人不知道他要驶向哪头◈✿★ღ，那么任何风都不是顺风◈✿★ღ。2020/6/4 12:28:5512:28:5504 June 2020 17◈✿★ღ、一个人如果不到最高峰◈✿★ღ，他就没有片刻的安宁凯时尊龙官网◈✿★ღ。◈✿★ღ，他也就不会感到生命的恬静和光荣◈✿★ღ。12:28:55 下午12:28 下午12:28:556月-20

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