基因工程（Geneticengineering）原称遗传工程✿✿✿★。从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体（受体)内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状.因此,供体✿✿✿★、受体和载体称为基因工程的三大要素尊龙凯时官方网站✿✿✿★。

　　(1)删除不必要的DNA区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源DNA片段的装载量✿✿✿★。一般来说,大于20Kb的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定✿✿✿★。

　　（2）灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的mob基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证DNA重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数

　　（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列,即多克隆接头（Polylinker）,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入✿✿✿★。

　　将细菌接合因子✿✿✿★、酵母或人类染色体上的复制区✿✿✿★、分配区✿✿✿★、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体

　　为线状双链分子长度为在分子两端各有个碱基的单链互补粘性末端✿✿✿★。

　　引入合适的选择性标记基因,如含有启动子✿✿✿★、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列(lacZ）的乳糖操纵子片段（lac）✿✿✿★、组氨酸操纵子片段(his）以及抗生素抗性基因等✿✿✿★。

　　将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色.

　　（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列,使得重组DNA分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应.

　　限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）是一类能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶.

　　识别位点的特异性:每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4.5或6核苷酸组成的特定序列（靶序列)✿✿✿★。

　　切割位点的规范性:双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）✿✿✿★。

　　同尾酶（Isocandamers):识别位点不同,但切出的DNA片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶✿✿✿★。

　　Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口✿✿✿★。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口

　　①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基（—OH）,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基（-P）的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用✿✿✿★。

　　②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键✿✿✿★。

　　③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★。

　　④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口(nick）,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口(gap）.

　　⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子（NAD＋或ATP）

　　大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶✿✿✿★。分子量为76kDa✿✿✿★。

　　Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5→3’的核酸外切酶活性✿✿✿★。

　　如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割, 则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解, 两种DNA分子均含有相同的粘性末端, 因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子

　　T4—DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下, 能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子, 但平末端连接效率不高, 基因操作不经常采用✿✿✿★。

　　感受态的形成✿✿✿★。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类, 负责转化因子的结合✿✿✿★、切割及加工✿✿✿★。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子, 其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成, 使细菌胞壁部分溶解, 局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等✿✿✿★。

　　转化因子的结合✿✿✿★。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合, 单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上✿✿✿★。

　　转化因子的吸收✿✿✿★。双链 DNA 分子与结合蛋白作用后, 激活邻近的核酸酶,一条链被降解, 而另一条链则被吸收到受体菌中.

　　整合复合物前体的形成晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合, 形成整合复合物前体结构, 它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处尊龙凯时官方网站✿✿✿★。

　　转化因子单链DNA的整合✿✿✿★。供体单链DNA片段通过同源重组, 置换受体染色体DNA的同源区域, 形成异源杂合双链 DNA结构.

　　①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀, 同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来, 诱导大肠杆菌形成感受态✿✿✿★。

　　②Ca2+能与加入的DNA分子结合, 形成抗DNA酶（DNase)的羟基-磷酸钙复合物, 并黏附在细菌细胞膜的外表面上✿✿✿★。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时, 细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动, 并随之出现许多间隙, 为DNA分子提供了进入细胞的通道✿✿✿★。

　　③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞, 可以提高DNA的转化效率.

　　PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组, 此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合.

　　是指在细胞上施加短暂尊龙凯时官方网站✿✿✿★、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔, DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中, 这种方法称为电穿孔法.

　　转化细胞的扩增操作: 指转化完成之后细胞的短时间培养晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★。在实验时, 扩增操作往往与转化操作偶联在一起, 如:

　　抗药性筛选法的基本原理: 抗药性筛选法可区分转化子与非转化子尊龙凯时官方网站✿✿✿★、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点:

　　经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子✿✿✿★。为了进一步筛选出重组子, 可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选✿✿✿★。如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活, 这种抗药性标记就会消失, 从而筛选出阳性重组子✿✿✿★。

　　这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体.主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后, 在含有5—溴—4-氯—3—引哚——D-半乳糖苷(X-gal）平板上形成浅蓝色的噬菌斑✿✿✿★。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代）后, 重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力, 转入lac-宿主菌后, 在含有5-溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷 （X-gal）平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑✿✿✿★。

　　利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中✿✿✿★。

　　由于在载体DNA分子中, 外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应, 反应产物经琼脂糖凝胶电泳, 若出现特异性扩增DNA带, 并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子尊龙凯时官方网站✿✿✿★。

　　C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上, 荧光胺标记在Avidin上, 两者形成复合物, 即可将荧光胺标记在探针上, 发出的荧光也能使普通胶片感光✿✿✿★。如果将某一生色酶接在Avidin上, 并辅以合适底物, 则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术

　　一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后, 将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞, 然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定, 获得含有目的基因的重组子✿✿✿★。此时, 该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除✿✿✿★。

　　该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上, 经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交, 筛选出含有插入序列菌落✿✿✿★。

　　鸟枪法:将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上, 转化受体细胞, 形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子.

　　（原核生物的基因长度大都在2Kb以内, 真核生物的基因长度变化很大, 最大的基因可达100Kb以上)✿✿✿★。

　　如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体✿✿✿★；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体.

　　如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选, 则选择大肠杆菌作为受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选, 则选择能使目的基因表达的受体细胞.

　　利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段, 必须通过次级克隆或插入灭活, 在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析, 搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列✿✿✿★。

　　酶促逆转录主要用于合成分子质量较大, 转录产物mRNA易分离的目的基因.这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA, 即cDNA, 然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段, 与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆✿✿✿★。

　　绝大多数的线端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴, 利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离, mRNA会挂在层析住上, 后洗脱即可分离

　　PCR技术的基本原理✿✿✿★：类似于DNA的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物✿✿✿★。

　　①模板DNA的变性: 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链, 以便它与引物结合, 为下轮反应作准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合✿✿✿★；

　　③引物的延伸: DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链.

　　重复循环变性-—退火——延伸三过程, 就可获得更多的“半保留复制链”, 而且这种新链又可成为下次循环的模板✿✿✿★。每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★。

　　是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中, 以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因, 这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库✿✿✿★。

　　组成型启动子: 是指在该类启动子控制下, 结构基因的表达大体恒定在一定水平上, 在不同组织✿✿✿★、部位表达水平没有明显差异✿✿✿★。

　　组织特异启动子: 又称器官特异性启动子✿✿✿★。在这类启动子调控下, 基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性✿✿✿★。

　　诱导型启动子✿✿✿★：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下, 该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平✿✿✿★。目前已经分离了光诱导表达基因启动子晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★、热诱导表达基因启动子✿✿✿★、创伤诱导表达基因启动子晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等晚上在车上吃我的葡萄✿✿✿★。

　　终止子: 是位于结构基因下游的一段DNA序列, 基因转录时, 该序列被转录为mRNA的一部分, 并形成特殊的二级结构, 由此终止基因的转录✿✿✿★。

　　SD序列:mRNA中起始密码子上游8—13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始

　　由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性, 因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择✿✿✿★。一般而言, 有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达:

　　在某些生长条件下, 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子, 它们致密地集聚在细胞内, 或被膜包裹或形成无膜裸露结构, 这种水不溶性的结构称为包涵体尊龙凯时人生需要博✿✿✿★，尊龙凯时登录✿✿✿★，尊龙ag旗舰厅登录✿✿✿★，人生就是搏✿✿✿★，尊龙人生尊龙官方✿✿✿★，